Анонсы статей



ГОЛОВНА
ГОЛОВНА Поиск
 

статьи схожей тематики

В. В. Тец, Г. Ю. Кнорринг, Н. К. Артеменко, Н. В. Заславская, К. Л. Артеменко
Влияние экзогенных протеолитических ферментов на бактерии

Рост и развитие бактерий сопровождаются выделением ими в окружающую среду различных ферментов, необходимых для переваривания субстрата и разрушения токсических веществ, включая антибиотики, вырабатываемые другими микроорганизмами или применяемые для лечения. Эти свойства бактерий много лет являются объектом многочисленных исследований. Меньше известно о действии на бактерии экзогенных ферментов. В последние годы резко возрос интерес к кооперативным системам, образуемым бактериями в естественных условиях существования, одной из которых является организм человека.


Кооперация бактерий приводит к формированию различных типов микробных сообществ, общим свойством которых является их относительная изолированность от внешней среды [3, 5–7]. Бактерии, находящиеся в составе микробных сообществ, в частности биопленок, становятся менее доступными для действия различных внешних факторов — антибиотиков, металлов, пестицидов и др. [1, 4, 7]. На пути к бактериям у антимикробных препаратов находятся поверхностные пленки и межклеточный матрикс, отграничивающие клетки сообщества от внешней среды [3, 10–13]. В результате бактерии внутри сообществ, не изменяя своей индивидуальной чувствительности, лучше выживают в присутствии различных неродственных антибактериальных препаратов [2–4, 9].
Несмотря на очевидную актуальность для практической медицины, свойства биопленок остаются недостаточно изученными, а данные о действии на них ферментов практически отсутствуют. Недостаточно также знаний о совместном действии антимикробных препаратов и ферментов на бактерии в биопленках.
В связи с этим целью исследования бы­ло изучение особенностей действия экзо­генных ферментов на микробные сообщества и выживаемость бактерий в биопленках в присутствии антибиотиков.


Материалы и методы

В работе использованы тест-штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий из различных коллекций: Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 и выделенные от больных с флегмонами и абсцессами в области головы и шеи, а также от больных шигеллезами в клиниках Санкт-Петербурга в 2003–2004 гг. — Staphylococcus aureus VT-38, Staphylococcus epidermidis VT-27 и
VT-43, Shigella flexneri 2a-VT12406.
Питательные среды: бульон Мюллера–Хинтон, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), минимальная синтетическая среда М-9, среда Мюллера–Хинтон (БиоМерье).
Жизнеспособность бактерий изучали, определяя число колониеобразующих единиц (КОЕ). Для этого готовили последовательные десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия и по 0,1 мл высевали на агаризованную среду, после чего инкубировали 24 ч при 37 °С и подсчитывали количество выросших колоний. Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли на плотной питательной среде с использованием диско-диффузионного метода и метода серийных разведений.
Использованы: ферменты — папаин (Loba Chemie), трипсин (Sigma, США) и ферментный комплекс вобэнзим (Мукосфарма); антибиотики — ампициллин (Hemofarm DD, Югославия), гентамицин (Lederle, США), линкомицин, цефотаксим (Lek DD, Словения), ципрофлоксацин (Bayer, Германия), рифампицин (Sigma, США), канамицин (Мосхимфармпрепараты, Россия), хлорамфеникол (Акрихин, Россия), нистатин (Rivopharm, Швейцария).
Получение биопленок в стеклянных флаконах: на дно флакона помещали покровное стекло, вносили 0,4 мл ночной бульонной культуры (5х108 КОЕ/мл), инкубировали 3 ч при 37 °С и после этого добавляли свежую среду до 2 мл. Флаконы выдерживали требуемое время при 37 °С. Ферменты в концентрации 100 мг/л вносили в различные сроки формирования биопленки: вместе с микробами, через 3 ч после добавления свежей среды и после 24 ч роста. Формирование биопленки оценивали микроскопически, для чего покровные стекла извлекали из флаконов, отмывали фосфатным буфером, фиксировали 96 % этиловым спиртом и окрашивали раствором генцианового фиолетового. Жизнеспособность бактерий определяли, подсчитывая количество микроорганизмов, содержащихся в среде и дающих рост на агаре (КОЕ). Состояние биопленки оценивали через 4, 6, 24, 48 и 72 ч роста. В качестве контроля использовали биопленку, образованную бактериями, не обработанными ферментами.
Для получения биопленок на дне лунок также использовали пластиковые 96-луночные планшеты (Sarstedt, Германия). В лунки вносили по 0,1 мл бульонной культуры бактерий (5х107 КОЕ), выращивали в течение 24 ч при 37 °С, а затем добавляли ферменты в количестве 0,5–100 мг/л и инкубировали еще 24 ч. Состояние биопленок оценивали после промывания фосфатным буфером, окраски генциановым фиолетовым и учета результатов на ридере (Stat-Fax-2100).


Результаты и их обсуждение

Использованные нами ферменты в добавленной концентрации
1000 мг/л не угнетали рост исследованных микроорганизмов на жидкой и агаризованной питательных средах. Установлено, что все исследованные штаммы уже через 24 ч роста образуют на поверхности стекла или на дне лунок планшетов биопленку, которая увеличивается по площади и плотности при продолжении культивирования.
Добавление папаина, трипсина или вобэнзима в питательную среду одновременно с засевом у всех испытанных бактерий вызывало изменение свойств биопленок. Характер выявленных различий зависел от количества внесенного фермента и типа питательной среды. У грамотрицательных бактерий в богатой питательной среде (МПБ) ферменты в дозе 100 мг/л ускоряли формирование биопленок. В присутствии испытанных ферментов через 24 ч культивирования биопленка соответствовала таковой в контроле через 48–72 ч роста. Число бактерий, способных образовывать колонии на агаре (КОЕ) в жидкой фазе, в присутствии использованных ферментов в этих условиях также увеличивалось в 5–10 раз по сравнению с контролем. При этом число КОЕ в контроле составляло в среднем 6х108–8х108, а в присутствии ферментов — 3х109–6х109. Грамположительные бактерии на богатой среде в присутствии 100 мг/л ферментов, добавленных одновременно с бактериями, образуют измененные биопленки, которые имеют меньшую площадь с нечеткими границами. Во всех полях зрения наблюдается большое количество одиночных микроорганизмов, не вошедших в видимые кооперативные взаимодействия.
При продолжении инкубации различия между биопленками, образованными в присутствии ферментов и в контроле, увеличиваются. Через 72–96 ч биопленки E.coli исчезают практически полностью. В контроле в этих же условиях они сохраняются минимум 144 ч. Биопленки стафилококков, образованные в присутствии ферментов, сохраняются в течение 144 ч и исчезают только при увеличении продолжительности инкубации до 240 ч. В контроле в эти же сроки биопленка сохраняет свои свойства.
Полученные данные свидетельствуют о том, что на богатой среде, содержащей значительное количество белков, протеолитические ферменты и вобэнзим, добавленные одновременно с бактериями, усиливают формирование биопленок и оказывают влияние на все стадии их развития, начиная с процесса прикрепления бактерий к поверхности. В то же время при такой схеме постановки эксперимента эти ферменты вызывают образование биопленок с измененными свойствами, что проявляется их непродолжительной “жизнью” и сравнительно быстрым исчезновением. Выявленное ускорение образования биопленок при добавлении бактерий одновременно с ферментами могло быть связано с действием последних на компоненты богатой мясопептонной среды. Для проверки такой возможности мы выращивали кишечную палочку на минимальной синтетической среде М- 9, которая не содержит белков, а только отдельные аминокислоты в известном количестве, сахар в качестве источника углерода и никотиновую кислоту, поскольку кишечные палочки, как правило, не могут ее синтезировать сами.
На минимальной среде М-9 в присутствии отдельных ферментов или вобэнзима происходило выраженное угнетение формирования биопленок использованных штаммов E.coli (рис. 1). Содержание живых бактерий в жидкой фазе было стабильным. Не отмечено увеличения числа КОЕ, которое в пробах с препаратами и в контроле составляло 0,7х109–1,1x109. Число КОЕ после 144 ч роста во всех пробах однотипно снизилось в 10 раз: до 0,7x108–1,0х108.
Отсутствие ускорения образования биопленок в таких условиях указывает на то, что зарегистрированные изменения скорости развития биопленки и увеличение числа КОЕ на богатой среде, скорее всего, действительно связаны с облегчением для бактерий получения питательных веществ на фоне активности добавленных ферментов.
Влияние ферментов на развитие биопленки на стадиях, следующих за адгезией, изучали, внося испытуемые препараты через 3 ч вмес­те с заменой питательной среды. При этом также удаляли все неадгезированные микроорганизмы, и во флаконах оставались только бактерии, плотно прикрепившиеся к стеклу. Ферменты, добавленные в количестве 100 мг/л через 3 ч, на богатой и минимальной средах частично угнетали дальнейшее увеличение биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий использованных штаммов. Наблюдалось уменьшение, по сравнению с контролем, числа скоплений бактерий, изолированных от внешней среды.
Таким образом, добавление ферментов или их комплекса после адгезии бактерий (через 3 ч) приводит к уменьшению количества и выраженности биопленок. Это позволяет считать, что действие ферментов не ограничивается изменением характера прилипания бактерий к мишени.
Влияние ферментов на морфологию уже образованных биопленок разного возраста оценивали, добавляя ферменты в количестве 100 мг/л через 24 и 48 ч. Бактериальные сообщества после 24 ч роста начинают отграничиваться от внешней среды поверхностными оболочками, а через 48  ч уже практически трудно найти свободные, не изолированные микробные клетки. Добавление ферментов или вобэнзима к 24- и 48-часовым биопленкам E.coli и стафилококка на богатой среде через 72–96 ч приводило к их увеличению, за которым следовало ускоренное разрушение. На минимальной среде (E.coli) ферменты не вызывали увеличения массы биопленки, а наблюдалось только ускорение ее старения.
Для изучения зависимости действия ферментов от использованной дозы к биопленкам, сформировавшимся на дне лунок в течение 24 ч в богатой питательной среде, добавляли испытуемые вещества в дозе 0,5–100 мг/ л. Для большинства использованных штаммов добавление папаина, трипсина или вобэнзима в количестве 100 мг/л и последующее культивирование в течение 24 ч приводило к увеличению массы биопленки. Этот результат воспроизведен для всех исследованных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Снижение дозы вобэнзима до 50–
5 мг/л в аналогичных условиях приводило к угнетению образования биопленок исследованных неродственных штаммов. Угнетение носило дозозависимый характер, что свидетельствует о специфичности эффекта. Папаин и вобэнзим в дозе 0,5–50 мг/л угнетают формирование биопленок кишечной палочки (рис. 2, 3). При снижении дозы фермента до 0,5  мг/ л этот эффект ослабевает. Различные штаммы грамположительных бактерий одного вида (Staphylococcus spp.) обладают схожей чувствительностью к действию испытанных ферментов. Папаин в дозе 0,5–50 мг/л угнетал образование биопленок у 50 % тестированных штаммов. Вобэнзим показал большую активность и в дозе 0,5 мг/л угнетал образование биопленок у 75 % тестированных штаммов данного рода.
Торможение процесса формирования биопленки в минимальной среде в присутствии ферментов свидетельствует о прямом воздействии на этот процесс использованных препаратов. Поскольку сами ферменты не оказывают токсического действия на тестированные микроорганизмы и действуют после адгезии бактерий, можно предполагать, что они разрушают определенные белки, необходимые для колонизации и образования биопленки.
Влияние ферментов на выживаемость бактерий в присутствии антибиотиков было изучено на различных бактериях, патогенных для человека. Антимикробные препараты были выбраны из неродственных групп с различными механизмами действия. Ферменты и антибиотики добавляли к 24-часовой бульонной культуре в одинаковой концентрации (100 мг/л) с последующим совместным выращиванием в течение 24 ч. Антибиотики сами по себе в такой концентрации, в 100–10 000 раз превышающей их МПК, не вызывали полной гибели микроорганизмов. Выживаемость бактерий в таких условиях наблюдалась у всех использованных штаммов, чувствительных к антибиотикам, вне зависимости от природы добавленных препаратов. Одной из причин такой выживаемости бактерий может быть образование ими на дне и стенках пробирок различных биопленок, делающих часть микробов малодоступными для антибиотиков. Число жизнеспособных бактерий, растущих диффузно (планктонный рост), в присутствии только антибиотика уменьшается примерно в 100 раз, а при действии совместно с ферментами — в 1000 раз. Таким образом, ферменты способствуют снижению выживаемости бактерий в присутствии антибиотика. Эффект снижения числа жизнеспособных бактерий сохраняется при увеличении продолжительности инкубации бульонной культуры с антибиотиками и ферментами до 48 ч и более.
При изучении совместного действия ферментов и антибиотиков на бактерии в биопленках препараты использовали в концентрациях, составляющих 5–100 МПК для диффузно растущих бактерий. Применение антибиотиков в дозе, соответствующей МПК, не показало статистически значимого снижения числа КОЕ в биопленках всех исследованных штаммов. Такое повышенное выживание бактерий в биопленках в присутствии антибиотиков в подавляющих их рост концентрациях соответствует данным литературы [3, 5, 8].
Для стандартных штаммов и бактерий, изолированных от больных, были получены результаты с рядом характерных особенностей. Общим оказалось снижение выживаемости бактерий в биопленках в присутствии антибиотиков и ферментов, взятых в концентрациях, при которых они по отдельности почти не изменяли числа КОЕ в сообществе. Этот эффект зарегистрирован как у грамотрицательных, так и у грамположительных бактерий. В присутствии папаина число КОЕ в биопленках при действии различных антибиотиков снижалось в среднем в 2–4 раза, а в присутствии вобэнзима — в 2–10 раз. Наибольшее усиление действия в присутствии вобэнзима зарегистрировано у гентамицина.
Полученные результаты свидетельствуют, что ферменты в небольших концентрациях могут не только частично угнетать образование биопленок, но и усиливать действие на них различных неродственных антибиотиков. Такой эффект имеет важное практичес­кое значение, поскольку в организме человека к моменту появления симптомов заболеваний бактерии всегда уже проходят стадию колонизации и находятся в составе различных моно- и смешанных микробных сообществ, отграниченных от внешней среды. Испытанные ферменты примерно в одинаковой мере увеличивали эффективность действия различных неродственных антибиотиков, что свидетельствует о неспецифичном общем увеличении поступления препаратов в биопленки.
Таким образом, применение ферментов, не влияющих на жизнеспособность или чувствительность отдельных микроорганизмов к антибиотикам, можно считать полезным для эффективной борьбы с бактериальными инфекциями.




Литература

[1] Заславская Н. В., Артеменко Н. К., Чижевская М. М., Тец. В. В. Особенности выживаемости бактерий в микробных сообществах// Клин. микробиол., антимикроб., химиотер. – 2000. – № 2. – С. 2–19.
[2] Заславская Н. В., Тец В. В. Влияние времени преинкубации на значения МПК при определении чувствительности методом Е-тестов// Клин. микробиол., антимикроб., химиотер. – 2000. – № 2. – С. 2–20.
[3] Тец В. В. Бактериальные сообщества. В кн.: Клеточные сообщества/ Под ред. В. В. Теца. – СПб.: 1998. – С. 15–73.
[4] Тец В. В., Заславская Н. В. Выживаемость бактерий, растущих диффузно и образующих газон, в присутствии гентамицина и ионов металлов. Труды РАЕН, 2000. – С. 77–82.
[5] Costerton J. W., Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections// Science. – 1999. – V. 284. – P. 1318–1322.
[6] Davey M. E., O’Toole G. A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics// Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2000. – V. 64. – P. 847–867.
[7] Leonardo M. R, Rossi M. A., Silva L. A., Bonifacio К. С. ЕМ evaluation of bacterial biofilm and microorganisms on the apical external root surface of human teeth// J. Endod. – 2002. – V. 28. – P. 815–818.
[8] Microbial biofilms/ Ghannoum M., O’Toole G. A. eds. – Washington, 2004.
[9] O’Toole G. A., Kaplan H. В., Kolter R. Biofilm formation as microbial development// Ann. Rev. Microbiol. – 2000. – V. 54. – P. 49–79.
[10] Tetz V. V. The effect of antimicrobial agents and mutagen on bacterial cells in colonies// Med. Microbiol. Lett. – 1996. – V. 5. – P. 426–436.
[11] TetzV.V., Korobov V. P., Artemenko N. K. Extracellular phospholipids of isolated bacterial communities. Biofilms. – 2004. – P. 1–7.
[12] Tetz V. V., Rybalchenko O. V., Savkova G. A. Surface films of Escherichia соli colonies// FEMS Microbiol. Lett. – 1993. – V. 107. – P. 231–240.
[13] Tetz V. V., Rybalchenko О. V., Savkova G. A. Ultrastructure of surface film of bacterial colonies// J. Gen. Microbiol. – 1993. – V. 137. – P. 1081–1086.


Статьи на похожую тематику:

1. М.Ю.Зак, Л.Н.Мосийчук Применение пищеварительных ферментов при синдроме мальдигестии/мальабсорбции

2. Влияние препарата дженагра (силденафила цитрат) на состояние кавернозной гемодинамики

3. Р.Я.Адаменко, Ю.И.Головченко, А.Л.Сиделковский, Т.М.Рябиченко Влияние прамистара на течение хронической недостаточности мозгового кровообращения

4. И.В.Багдасарова, А.М.Боярская, О.И.Осадчая, Б.С.Шейман Влияние энтеросорбента Энтеросгель на активность антимикробной резистентности у детей с пиелонефритом

5. В.В.Гебеш, Ю.А.Сухов, А.П.Голуб Влияние Энтеросгеля на уровень провоспалительных цитокинов при лечении больных острыми кишечными инфекциями и корью

6. Е.Н.Клигуненко, Е.Ю.Сорокина, С.В.Сопрун, А.А.Биденко, А.Л.Тельнов Влияние ГЭК II поколения на центральную гемодинамику при дегидратации, связанной с острой хирургической патологией

7. В.И.Целуйко, О.В.Пелецкая, О.В.Радченко, А.В.Жадан /кардіологія/ Влияние Лизиноприла на показатели суточного мониторирования артериального давления и динамику эхокардиографических показателей у больных гипертонической болезнью



зміст