Анонсы статей



ГОЛОВНА
ГОЛОВНА Поиск
 

статьи схожей тематики

П.М.Перехрестенко, Г.Т.Глухенькая, Т.А.Калиниченко
Роль криоконсервированных гемопоэтических клеток в клинической практике

П.М.ПЕРЕХРЕСТЕНКО, д.м.н., профессор; Г.Т.ГЛУХЕНЬКАЯ, к.м.н.; Т.А.КАЛИНИЧЕНКО, к.м.н.
/Институт гематологии и трансфузиологии АМН Украины, Киев/


На сегодняшний день убедительно доказана лечебная эффективность пересадок гемопоэтических клеток при гематологических и онкологических заболеваниях, тяжелых наследственных и приобретенных иммунодефицитах, а также болезнях обмена. Внедрение данного метода в комплексы лечебных мероприятий требует наличия определенных запасов ткани и, таким образом, неразрывно связано с разработкой методов ее консервирования. При этом наиболее приемлемыми для клеток условиями являются ультранизкие температуры (–196°С) в хранилищах с жидким азотом, поддерживающие состояние их анабиоза с прекращением процессов жизнедеятельности. В Институте гематологии и трансфузиологии АМН Украины (ИГТ АМНУ) разработки в этом направлении были начаты еще в 1963 г. под руководством профессора С.С.Лаврика и ведутся уже более 40 лет.
Одной из первоочередных задач, стоявших перед исследователями в начале изучения метода, была разработка ограждающего раствора, содержащего криопротектор. Такой раствор препят­ствует пагубному воздействию факторов консервирования, основным среди которых является процесс формирования льда, на живую клетку. Уже в 1965–1969 годах группой ученых института были получены авторские свидетельства — на оригинальный ограждающий раствор (криоконсервант) для клеток гемопоэтической ткани на основе крио­протектора — низкомолекулярного поливинилпирролидона (ПВП), а также на способ консервирования гемопоэтических клеток костного мозга при низких и ультранизких температурах под защитой этого криоконсерванта. Способ был теоретически основан на защите клетки с помощью вязкой оболочки, задерживающей чресмембранное продвижение воды. Формирование такого барьера при участии раствора обволакивающего клетку криопротектора ПВП предотвращает прогрессирующее обезвоживание клетки, а также предупреждает пагубное воздействие на клеточные структуры процесса первичного образования кристаллов льда, происходит замена его аморфным стеклоподобным состоянием. Суть проведенных в те годы исследований заключалась в изучении в динамике (на протяжении 20 лет наблюдения) влияния ультранизкой температуры на жизнеспособность гемопоэтических клеток, криоконсервированных указанным способом при температуре жидкого азота.
Результаты исследований продемонстрировали возможность длительного хранения гемопоэтических клеток в биологически полноценном состоянии, что имело на тот момент огромное значение для обоснования создания запасов с целью клинического применения. Таким образом, была получена реальная возможность включения миелотрансплантаций в комплекс лечебных мероприятий. Уже в 1964 г. впервые в Украине профессор С.С.Лаврик разработал метод аутотрансплантации криоконсервированного костного мозга онкологическим больным. При этом была получена возможность расширения показаний к применению мощных доз лучевой и химиотерапии, что положительно повлияло на качество лечения. За период 1965–1988 гг. в онкологических клиниках Киева было проведено 215 таких трансплантаций при непосредственном участии сотрудников института.
В тот же период создаются запасы донорского костного мозга, типированного по антигенам системы HLA (локусы А и В). Образцы из этих резервов трансплантировали при гипопластических анемиях и миелодепрессивных состояниях у онкологических больных после лучевой и цитостатической терапии. Многолетний опыт гематологической клиники института (зав. клиникой — профессор А.Ф.Романова) свидетельствовал: проведенная дотрансплантационная иммунодепрессивная терапия в сочетании с высокой сохранностью биологической активности клеток криоконсервированного миелотрансплантата способствовали его временному приживлению на период восстановления иммуногемопоэза реципиента.
В 1986 г. банк гемопоэтических клеток костного мозга сыграл роль стратегического запаса гемопоэтической ткани для борьбы с выраженной панцитопенией крови и гипоплазией костного мозга как симптомокомплексами острой лучевой болезни у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС. В этих условиях единственным потенциально возможным средством спасения больных была пересадка донорского костного мозга, который взял бы на себя временную функцию кроветворения.
На тот момент опыт сотрудников института по трансплантации костного мозга, запасы фенотипированных донорских клеток, а также высокая квалификация специалистов иммунологической лаборатории типирования костного мозга (зав. лабораторией — канд. мед. наук Л.И.Тимошенко) позволили в короткие сроки осуществлять подбор как криоконсервированного (сроки хранения в жидком азоте — от 10 дней до 8 лет), так и свежезаготовленного костного мозга для конкретных больных. Ожидаемый эффект был достигнут как в первом, так и во втором случае (С.С.Лаврик, 1986). К условиям достижения положительного результата алломиелотранс­плантаций в комплексном лечении таких больных были отнесены: ранняя диагностика степени миелодепрессии, быстрый подбор совместимого по HLA-антигенам свежезаготовленного или криоконсервированного донорского костного мозга с высокой морфофункциональной активностью клеток (после размораживания, независимо от сроков хранения в жидком азоте) (Л.П.Киндзельский, 1999).
Современные классические подходы к трансплантации гемопоэтических клеток при лечении онкологических, онкогематологических больных, а также пациентов с врожденными дефектами стволовой клетки предусматривают использование токсических миелоаблативных режимов кондиционирования с целью удаления опухолевых или функционально дефектных стволовых клеток, а также индукции глубокой иммуносупрессии. Основная роль миелотрансплантата при этом — восстановление донорского гемопоэза в организме реципиента. Такая практика ужесточила требования к качеству материала для пересадки относительно увеличения объемов, а также тщательности подбора пар “донор–реципиент”. В современных условиях аутотрансплантации гемопоэтических клеток по-прежнему являются наиболее востребованными благодаря эффективности приживления и экономичности метода по сравнению с аллотрансплантациями гемопоэтической ткани. Чаще всего с этой целью используются стволовые клетки периферической крови, так как в таком случае существует меньшая, по сравнению с аутологичным костным мозгом, вероятность контаминации опухолевыми клетками. Мобилизация гемопоэтических клеток в периферическое русло достигается в результате проведения химиотерапии препаратами с относительно небольшой длительностью воздействия на стволовую клетку (циклофосфамид, этопозид), а также с помощью стимуляции гемопоэтическими факторами роста (гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, гранулоцитарно-макрофагальным колоние­стимулирующим фактором).
Главным источником аллогенной гемопоэтической ткани по-прежнему остается донорский костный мозг. Для оперативного решения вопросов аллотрансплантации необходимо наличие донорских регистров, а также достаточных запасов криоконсервированной ткани. На сегодняшний день такие регистры HLA-типированных доноров-добровольцев существуют в Европе и США. Однако основными проблемами, стоящими на пути миелотрансплантации, наряду с ее высокой себестоимостью являются трудности подбора донора, связанные с редкой повторяемостью HLA-фенотипа в популяции (1:10 000). В связи с этим последние 15 лет внимание ученых всего мира сосредоточено на изучении альтернативного костному мозгу источника гемопоэтических клеток — пуповинной (кордовой, плацентарной) крови, первая трансплантация которой была осуществлена в 1988 г. в Париже ребенку с анемией Фанкони (Gluckman E. et al., 1989). Легкость заготовки материала лишает его основных отрицательных моментов, присутствующих при заборе традиционных источников гемопоэтической ткани, связанных как с риском для донора, так и с трудоемкостью самой процедуры. Возможность создания достаточных запасов этой ткани делают реальным быстрый подбор необходимого аллогенного материала. Все эти моменты значительно снижают себестоимость такой трансплантации.
С 1995 г. в ИГТ АМНУ проводятся исследования, конечной целью которых является применение потенциала пуповинной крови как источника стволовых кроветворных клеток для клинических трансплантаций. Результаты изучения свойств клеточно-компонентного состава пуповинной крови, полученные специалистами института, подтвердили наличие особенностей популяционного состава клеток — эффекторов как предпосылки формирования иммунологической толерантности. Состав популяций лейкоцитов отличается, с одной стороны, относительно повышенным содержанием незрелых клеток и клеток-супрессоров среди лимфоцитов, с другой — сниженным содержанием среди моноцитов клеток — носителей структур, определяющих их функциональную активность в межклеточных иммунных реакциях. Признаки функциональной незрелости иммунокомпетентных клеток, выражающиеся в диспропорции продукции медиаторов и чувствительности к ним, сниженная цитотоксическая активность лежат в основе формирования иммунотолерантности этой ткани (Harris D.T. et al., 1992).
Известно, что в настоящее время в качестве индикатора наличия в трансплантате гемопоэтической ткани так называемых высокопотентных стволовых клеток используют поверхност­ноклеточный гликофосфопротеин CD34. Изучение специалистами института клеточного состава мононуклеаров пуповинной крови подтвердило присутствие среди них CD34-положительных клеток. Существуют многочисленные свидетельства количественного и качественного превышения некоторых показателей гемопоэтического потенциала самых ранних кроветворных клеток пуповинной крови по отношению к костному мозгу взрослого донора. Это обстоятельство является основанием для оптимистического взгляда на проб­лему ограниченного количества получаемых во время родов гемо­поэтических клеток. Дело в том, что, по мнению некоторых авторов, потенциальными трансплантатами пуповинной крови, достаточными по количеству клеток для взрослых доноров с массой тела 50–70 кг, следует считать только 25% образцов, в то время как все 100% заготовок можно использовать лишь для детей весом до 10 кг (Kogler G. et al., 1998).
Только опыт клинических трансплантаций может поставить точку в дискуссии по вопросу достаточности потенциала одного образца пуповинной крови для восстановления гемопоэза взрослого реципиента, однако многочисленные работы по изучению ее биологии вселяют надежду на положительный результат. Онтогенетическая обусловленность высокой способности гемопоэтических клеток пуповинной крови к самовоспроизведению и дифференцировке в любую линию клеток крови и иммунной системы связана с особенностями их клеточной сигнализации, наличием чувствительных рецепторов к факторам роста, с удлиненным клеточным циклом, способностью к выработке факторов роста. Таким образом, существуют природные предпосылки к состоятельности трансплантатов пуповинной крови в организме реципиентов различных возрастных категорий. Подтверждением тому может служить сравнительная характеристика состава и функциональных особенностей субпопуляции CD34-положительных гемопоэтических клеток пуповинной крови и костного мозга (Hows J. et al., 1992; Di Giusto et al., 1996; Lu L. et al., 1993; Qian-Lin Hao et al., 1995) (таблица).
Мировой опыт проведенных к настоящему времени трансплантаций пуповинной крови (более 1,5 тысяч наблюдений) пациентам с различными видами патологии свидетельствует в пользу высокого трансплантационного потенциала этого материала (Rubinstein P. et al., 1998; Gluckman E. et al., 2000; Gluckman E., Broxmeyer H.E., 2001; Laughlin M. et al., 2001; Rosha V. et al., 2001). По этим данным состоятельность трансплантата зависит от количества введенных ядросодержащих клеток. Лучшие результаты получены при трансплантациях от 3х107/кг массы реципиента и выше. Для костного мозга рекомендованная доза значительно выше и составляет не менее 20х107/кг. Особого внимания заслуживает тот факт, что вероятность успешной трансплантации пуповинной крови при неполной совместимости пары “донор–реципиент” (расхождения по 1–3 аллелям HLA-системы) выше, чем при трансплантациях костного мозга подобной степени совместимости, а также частота и тяжесть развития иммунного конфликта “трансплантат против хозяина” в организме реципиента пуповинной крови существенно ниже.
Развитие трансплантации клеток пуповинной крови тесно связано с разработкой методов ее забора и длительного хранения. Морфологическая и функцио­нальная сохранность клеток зависит от степени повреждающего воздействия на них в процессе хранения, размораживания и подготовки к введению в организм реципиента. Каждому из этих этапов должно быть уделено надлежащее внимание специалистов.
В ИГТ АМНУ с целью получения стерильного, не загрязненного материнскими клетками образца пуповинной крови применяется метод ее забора в так называемой “закрытой” системе. При этом забор крови из пупочной вены сразу же после отделения новорожденного позволяет получить достаточный объем с большим содержанием гемопоэтических клеток.
Разработки в области криоконсервирования гемопоэтических клеток пуповинной крови являются логическим продолжением многолетних исследований влияния факторов низких температур на сохранность гемопоэтических тканей и используются при работе банка гемопоэтических клеток для их длительного хранения с целью дальнейшего клинического применения.
Защищенные патентами технологии низкотемпературного консервирования гемопоэтических клеток нефракционированной (цельной) и фракционированной пуповинной крови позволяют длительно сохранять клетки практически без снижения их жизнеспособности. Целесообразность разработки различных по своей сути технологий оправдана существованием разнообразных клинических ситуаций, а также конкретных обстоятельств заготовки, от которых зависит качество получаемых во время родов образцов относительно их объемов. При получении малых объемов целесообразно замораживать образцы цельной крови. Удаление продуктов гемолиза в этом случае осуществляется по разработанной нашими специалистами технологии подготовки клеток к клиническому использованию. В то же время объемные образцы подлежат замораживанию после удаления большинства эритроцитов (с помощью плазмозамещающего раствора, содержащего гидроксиэтилкрахмал). В качестве криопротектора применяется медицинский низкомолекулярный (8000±2000) ПВП, значимой положительной характеристикой которого является биологическая инертность. Такой подход существенно упрощает подготовку размороженных клеток к введению в организм реципиента. Немаловажным моментом при создании государственных банков компонентов пуповинной крови является сравнительно низкая себестоимость указанного криопротектора, что делает его использование предпочтительным относительно других веществ, например, очищенного медицинского диметилсульфоксида (ДМСО).
Результаты применения гемопоэтических клеток у онкологических больных с солидными опухолями различной локализации (рак молочной железы, рак яичника, рак желудка), а также с лимфогранулематозом и злокачественной лимфомой, находящихся на лечении в отделениях Института онкологии АМН Украины, показали эффективность включения трансфузий компонентов пуповинной крови в программы лечения симптомокомплексов стойких цитостатических миелодепрессий. Такой подход позволяет возобновить прерванные по причине развития синдрома угнетения кроветворения курсы противоопухолевой терапии. Уже на 6–7-е сутки после трансфузии достоверно повышаются показатели гемопоэза и иммунного статуса больных. Особенно иллюстративно в этом плане значительное повышение фагоцитарной активности нейтрофилов, фагоцитарного числа и показателя завершенности фагоцитоза.
Механизм действия криоконсервированных клеток пуповинной крови в данном случае рассматривается как результат гуморальной стимуляции кроветворения реципиента цитокинами, в частности, гемопоэтическими факторами роста, и временного приживления донорских клеток. Подтверждением тому является достоверное увеличение содержания фетального гемоглобина в периферической крови реципиентов на 7–14-е сутки после трансфузии.
Отсутствие у сенсибилизированных реципиентов каких-либо посттрансфузионных реакций является, с одной стороны, свидетельством качества трансфузионной среды, содержащей криоконсервированные клетки пуповинной крови, с другой — подтверждением относительной толерантности ее иммунокомпетентных клеток.
Благодаря эффективным технологиям хранения биологически полноценные гемопоэтические клетки пуповинной крови могут применяться также в комплексном лечении больных с патологией кроветворения, где выраженность миелодепрессивного синдрома связана с целенаправленным специфическим действием схем цитостатической терапии на стволовые гемопоэтические клетки, а также после жесткой кондиционной терапии у кандидатов на трансплантацию.
Таким образом, развитие инфраструктуры банка гемопоэтических клеток в направлении укрупнения запасов, тканевого типирования хранящихся в нем образцов, тестирования генетической, а также инфекционной безопасности материала с использованием современных молекулярных биотехнологий позволит своевременно и качественно использовать кроветворную ткань в клинических ситуациях различной степени сложности.

Список рекомендованной литературы находится в редакции.


Статьи на похожую тематику:

1. Применение цефоперазона в клинической практике

2. Применение липоевой кислоты (берлитиона) в клинической практике

3. Левофлокс (препарат ІІІ поколения фторхинолонов): возможности применения в клинической практике

4. Сравнительная оценка эффективности препаратов группы силденафила виагры и дженагры в клинической практике

5. Б.А.Кондрацкий, В.Л.Новак Опыт применения в клинической практике комплексного инфузионного препарата Реосорбилакт

6. Е.Ф.Чернушенко Апоптоз клеток иммунной системы и его значение в клинике

7. Е.Ф.Чернушенко Апоптоз клеток иммунной системы и его значение в клинике

8. Оценка клинической эффективности липразида — нового отечественного антигипертензивного препарата

9. В.Д.Розуменко Опухоли головного мозга: современные возможности клинической диагностики

10. Изучение детоксикационных свойств и клинической эффективности энтеросорбента “Энтеросгель” в комплексном лечении детей с пиелонефритом



зміст